Silver staining Polyacrylamide Gel for MALDI/TOF-MS(A)

  1. ゲル固定液を作成する.
    ゲル固定液
    酢酸EtOHBS 水total
    25 ml75 ml100 ml250 ml

  2. 泳動済みのアクリルアミドゲルを、ゲル固定液を入れた適切な大きさの容器に、ガラス板から外しながら移す.18x18cmサイズのゲルの場合、20x20のNuncの角シャーレを用いて、一回あたり200ml程度使用.
  3. 途中で1回〜数回、固定液を変えて(ゲルに付いたゴミなどをとるため)、3時間〜一晩ゆっくり室温で振盪する.

    (洗浄〜活性化)

  4. rinse: 20% EtOH(容器A:40ml EtOH + 160ml BS water /gel)で20分間振盪.
  5. wash: BS水で10分間振盪(容器A: 200ml/gel)
  6. sensitization: 0.02% チオ硫酸ナトリウム(容器A:10% sodium thiosulfate 400 μl+ 200ml BS water/gel)で10分間振盪

    (銀染色)※複数のゲルがあるときは1枚ずつ行うこと

  7. rinse: BS水(容器A: 200ml/gel)で20秒間ずつ3回すすぐ.
  8. silver incubation: 硝酸銀溶液(容器B: AgNO3, 0.4 g+BS water 200ml/gel)を加え、45分間振盪

    (発色)

  9. 銀溶液を専用の銀廃液ビン(B)に捨てる.
  10. wash: BS 水(容器B: 200ml/gel)で5〜10秒すすぐ(廃液→銀廃液へ)
  11. develop: 発色液(容器A:K2CO3, 6.0g+10% sodium thiosulfate 20μl+200ml BS water/gel, 使用直前にホルマリン50μlを加える)を加え、発色の程度を見ながら5〜10分間振盪する.(廃液→銀廃液へ)
  12. Fixation: 停止液(容器C: Tris base 10g+酢酸5ml+BS water 200ml/gel)を加え5分間振盪(廃液→銀廃液へ)
  13. rinse: BS水(容器B:200ml/gel)で10分間ずつ2回洗浄(廃液→銀廃液へ)
  14. rinse: 途中2回ほどBS水を替えながら振盪し洗浄(廃液は流しに流してよい)
  15. スキャナーなどでゲルを撮像し記録する.ゲルはBS水に漬した状態で4℃保存する.
    この状態で数カ月は in gel digestion→TOF-MSによる解析が可能.

  1. MALDI/TOF-MSを用いたpeptide mass finger printingのための銀染色.
    グルタルアルデヒドを用いた銀染色ではMS解析が不可能なのでこの方法を用いる.
  2. ガラスびんにconc.HClを入れておき塩化銀として沈殿させる.廃液がいっぱいになってきたら上清を酸廃液として捨てる.
    何回かに一度,HClは補充すること.

2002.2.27: 旦部. 作成