培養細胞からのゲノムDNAの調整


細胞がconfluentになった状態の10cmシャーレ(1〜2枚)を用意する。
  ↓
PBS(−)で2回洗う。
  ↓
シャーレにLysis buffer(total 4ml)を加える。

●Lysis bufferは以下のように調整してΣ20mlとする。
TEN 17.5ml
20%SDS 0.5ml
Proteinase K (2μl/ml)2ml
(TEN:10mM Tris-cl (PH7.4) ,10mM EDTA, 0.1N Nacl)

シャーレ上でよく振ってCell lysateを集め15mlポリプロピレンチューブに入れる。
  ↓
室温で一晩(あるいは55℃で90分)置く。

実験直前の準備
◎15mlポリプロピレンチューブを検体数×4だけ用意しそれぞれ番号を書く。
◎太いパスツールを検体数だけ用意し番号をかきポリプロピレンチューブに立て掛けておく。

次の1の操作を2回→2の操作を2回→3の操作を1回行う。

  1. フェノールを4ml加え、60分ローテーターでゆっくり震盪する。
    3,000rpmで3分遠心し、上の水層を太いパスツールで次のチューブに移す。

  2. クロロフォルム・イソアミルアルコール(48:2)を4ml 加え、30分ローテーターでゆっくり震盪する。
    3,000rpmで3分遠心し、上の水層を太いパスツールで次のチューブに移す。

  3. ジエチルエーテルを4ml加え、10分ローテーターでゆっくり震盪する。
    3,000rpmで3分遠心し、上のエーテル層を太いパスツールで取り除く。

  4. 3のチューブに、採取量×1/10の3M 酢酸ナトリウム(PH4.8)と採取量×2の100%エタノールを加えDNAを沈澱させる。

  5. ガラスパスツールの先をバーナー使って曲げたものを用意し、それでDNAを引っ掛けてとり、70%エタノール→100%エタノールの順で洗う。
    (1.5mlエッペンチューブに予めそれぞれ1mlずつ取っておく。)

  6. 15分乾燥させた後、ガラスパスツールの先についたDNAを500μlの1/10 TEに溶かし、4℃で一晩ローテーターで回転させる。

  7. 翌日、そこから10μlとり、MQ水90μlを加えOD260をスぺクトロフォトメーターで測定し、DNA量を算出する。
    DNA液は4℃で保存する。


2002.3.14 喜多.作成