LipofectAmine PLUS transfection

Day 1

  1. 細胞を計数し,以下の数でシャーレにまきこむ.

    60mm dish100mm dish
    5-10 x 105 cells/dish1-2 x 106 cells/dish
    培地:約 5 ml培地:約 15 ml
    使用する培地の例: 293T他, 10% FCS-DMEM (ps,f +: ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン加).NIH3T3, 5% CS-DMEM (ps,f +).

  2. CO2インキュベーターで37℃一晩培養.

DAY 2

  1. トランスフェクション

    ●溶液の組成


    60mm dish100mm dish
    Solution A.Opti-MEM
    (serum-free medium)
    250 μl750 μl
    plasmid DNA1-2 μg4 μg
    PLUS reagent8 μl20 μl
    Solution B.Opti-MEM
    (serum-free medium)
    250 μl750 μl
    lipofectAmine12 μl30 μl

    ○15ml ポリスチレンチューブ(透明)を使うこと.チューブの材質によってはDNAがくっついてロスする.
    ○本数が多いときはsample分だけまとめて作る.
    ○plasmid DNAはEt沈後,1/10 TE (sterile)で1ug/ulにしておくとよい.

    1. Solution Aを混合し、室温で15分インキュベート.
    2. Solution Bを用意,培地交換用のOpti-MEMを温めておく(上記待ち時間に)
    3. Solution AとBを混和し,室温で15分インキュベート.
    4. 細胞を巻き込んでおいたシャーレの培地を吸引除去し、温めておいたOpti-MEMを静かに加える(上記待ち時間に)
      60mm dishの場合:2 ml,100mm dishの場合:5 mlのOpti-MEMと交換.
    5. 培地交換したシャーレに,Solution (A+B)をゆっくりと1滴ずつ加える(ピペットマンで)

  2. CO2インキュベーターで3時間インキュベート.この間,培地pHの変動などを避けるため,極力CO2インキュベーターの開閉は避ける.
  3. 2倍濃度の血清を含む培地を等量(2.5ml or 6.5 ml)加え、CO2インキュベーターで(24〜)48時間培養する.
    293Tの場合,20%FCS-DMEM(ps,f +).NIH3T3の場合,10%CS-DMEM(ps,f +)

DAY 4

  1. 培地を吸引除去し,PBS(-)で1〜2回洗浄する.
    ※293Tは特にはげやすいので注意すること.
  2. 細胞を回収する.

2002.2.27: 旦部. 作成