LipofectAmine PLUS transfection

Day 1

1. 細胞を計数し，以下の数でシャーレにまきこむ．
   
   

   60mm dish	100mm dish
   5-10 x 105 cells/dish	1-2 x 106 cells/dish
   培地：約 5 ml	培地：約 15 ml

   使用する培地の例： 293T他, 10% FCS-DMEM (ps,f +: ペニシリン、ストレプトマイシン、ファンギゾン加)．NIH3T3, 5% CS-DMEM (ps,f +).
   
   
2. CO2インキュベーターで37℃一晩培養．

DAY 2

3. トランスフェクション
   
   ●溶液の組成

   		60mm dish	100mm dish
   Solution A.	Opti-MEM (serum-free medium)	250 μl	750 μl
   	plasmid DNA	1-2 μg	4 μg
   	PLUS reagent	8 μl	20 μl
   Solution B.	Opti-MEM (serum-free medium)	250 μl	750 μl
   	lipofectAmine	12 μl	30 μl

   
   ○15ml ポリスチレンチューブ（透明）を使うこと．チューブの材質によってはDNAがくっついてロスする．
   ○本数が多いときはsample分だけまとめて作る．
   ○plasmid DNAはEt沈後，1/10 TE (sterile)で1ug/ulにしておくとよい．
   
   
   1. Solution Aを混合し、室温で15分インキュベート．
   2. Solution Bを用意，培地交換用のOpti-MEMを温めておく（上記待ち時間に）
   3. Solution AとBを混和し，室温で15分インキュベート．
   4. 細胞を巻き込んでおいたシャーレの培地を吸引除去し、温めておいたOpti-MEMを静かに加える（上記待ち時間に）
      60mm dishの場合：2 ml，100mm dishの場合：5 mlのOpti-MEMと交換．
   5. 培地交換したシャーレに，Solution (A+B)をゆっくりと１滴ずつ加える（ピペットマンで）
   
   
4. CO2インキュベーターで3時間インキュベート．この間，培地pHの変動などを避けるため，極力CＯ2インキュベーターの開閉は避ける．
5. ２倍濃度の血清を含む培地を等量（2.5ml or 6.5 ml）加え、CＯ2インキュベーターで（24〜）48時間培養する．
   293Tの場合，20%FCS-DMEM(ps,f +)．NIH3T3の場合，10%CS-DMEM(ps,f +)

DAY 4

5. 培地を吸引除去し，PBS(-)で１〜２回洗浄する．
   ※293Tは特にはげやすいので注意すること．
6. 細胞を回収する．

2002.2.27: 旦部. 作成