QIAGEN kitによるplasmidの精製

1日目

  1. 500mlコルベンにLB培地(+Ampicilin) 80mlを入れて大腸菌を植え付け、12〜24h, 37℃でshaking cultureする。

2日目


  1. 50ml超遠心用チューブ(Beckman tube)2本に、1本当たり〜40mlの大腸菌cultureを、2本1セットで重量が均一になるように注入する。
    それを4,000rpmで10分間遠心する。遠心後、Supは最初のコルベンに集めてautoclaveで滅菌してから捨てる。

  2. 遠心後、P1液を10ml加えよくvortexして沈澱を溶かす。(沈澱が溶けるまでよくvortexすること。)

  3. P2液を10ml加え、転倒混和で混ぜる。(vortexするとgenomic DNAが切断されるのでしないこと。)
    これを室温で5分放置する。

  4. P3液を10ml加え、転倒混和で混ぜる。(白いモロモロ状のタンパク質やdebrisが生じる。)
    これを氷上で20分放置する。

  5. 12,000rpmで20分遠心する。遠心の間に、50ml Tube(古いものでよい)で受けた精製用カラムをセットし、QBT液10mlを加えて平衡化しておく。

  6. 遠心後、debrisができるだけ混入しないように注意しながらゆっくりピペットで吸い取り、〜40mlを精製用カラムに移す。

  7. カラムをQC液20mlで3回洗う。
    新しい50ml超遠心用チューブ(Beckman tube)に番号を書きカラムにセットし、QF液15mlをカラムに入れ溶出させる。(この時、plasmidとRNAが溶け出す。)

  8. この溶出した液にイソプロピルアルコール10.5mlを加え、転倒混和する。
    これを−20℃で2時間(あるいは−80℃で30分)冷凍庫に置く。

  9. 冷凍庫から取り出し10分程室温に置いて完全に溶かした後、12,000rpm,20分遠心する。
    (この時の沈澱は大変見にくいので、チューブの本体に矢印をつけておき、その矢印部分を遠心機の外側に向けて入れると、取り出した時、沈澱を確認しやすい。)

  10. 遠心後Supを捨て、キムタオルの上に逆さまに立て5分位置く。
    (この時、沈澱が流れて移動しやすいので気をつける。)

  11. TE 500μlを入れピペッティングでよく溶かし、番号をつけたEppen Tube(1.5ml)に移す。

  12. RNaseA(10mg/ml)を5μl加え、37℃で2時間以上incubateする。

  13. フェノール/クロロホルム液500μlで2回処理する。(vortex mix→遠心12,000rpmで1分→上の水層をとる)

  14. 1/10 vol 3M 酢酸ナトリウム(PH4.8) 、2.2vol EtOHを加え(14で取れた量の0.1倍、2.2倍ということ)、エタ沈する。
    それを−80℃に30分置く。

  15. 微量冷却遠心器で、12,000rpmで10分間遠心しSupを捨てる。

  16. 500μl 70% EtOHを加え沈澱を洗い、12,000rpmで5分遠心後Supを完全に除く。

  17. Eppen tubeのふたを開けたまま室温で乾燥させEtOHをとばす。

  18. 200μl1/10TEに溶かす。
    そこから2μlとりMQ水を98μl加えOD260で濃度を測定する。
    1μlを取り0.8%agarose minigelで15分電気泳動をしチェックする。

  19. 1/10 TEで1μg/μlの濃度に希釈しラベルを張り、−20℃で保存する。


2002.3.5 喜多.作成