DNAミニプレップ法(プラスミドの分離法)

(1日目)

  1. 14mlのファルコンチューブに適当な抗生物質の入ったLB培地を2mlを用意する。
    (アンピシリン25mg/mlのStock液を解凍して、1/250で使用する。)

  2. LB寒天培地プレート上にできた大腸菌コロニーをつまようじで突いてチユーブの培地に植える。
     チユーブとキャップは名称、番号、日付などを書いたテープでとめておく。
    (長めのテープでキャップとチューブを同時にとめるとよい。)

  3. 37℃で一晩培養する。

(2日目)

  1. 各チューブから1.0mlをエッペンチューブに移す。残りは4℃に保存する。

  2. 10,000rpmで20秒間遠心し、上澄みを除く。集めた上澄み液はオートクレーブするか、次亜塩素酸を加えることによって滅菌し捨てる。

  3. Sol.1(GTE buffer)を100μl加えて、強ボルテックスでよく撹拌する。その後2〜3分室温に置く。

  4. Sol.2(0.2N NaOH /1%SDS)を200μl加える。
    (Sol.2は通常、冷凍庫に保管されているので、使用する30分くらい前に出しておき湯煎して溶かしておく。解けると透明になる。また、ピペットマンはP1000を使用した方がよい。)
    必要なら弱くボルテックスして(ただし、DNAが切れ過ぎないよう5秒ほどにする。)菌を溶かす。
    2〜3分室温に置く。

  5. Sol.3(5M KOAc)を150μl加える。チューブを上下に数回強く振って、氷の上に10分間置く。
    (白く細かいモロモロの沈澱ができる。また、氷の中におく時間を多少長めにとった方が、遠心にかけた時白いモロモロの沈澱が固まりやすい。)

     
  6. 14,000rpmで15分遠心する。
    (遠心は4℃で行う方がよい。その間に、新しいエッペンチューブを用意し、番号、名前を記入しておく。)
    上澄み(〜400μl)を(上のモロモロの白い膜を押しのけるようにして)ピペットで新しいチューブに移す。
    そこに500μlのIsopropanolを加え、チューブを2,3回ひっくり返して良く混ぜ、氷の上に15分おく。

     
  7. 12,000rpmで5分間遠心する。吸引して上澄みを除く。
    (沈澱を吸引しないように注意しながら、できるだチューブの壁についた水滴を吸引する。)

  8. 沈澱の入ったチューブをペーパータオルの上に逆さに立て掛け乾燥させる。
    (完全に乾燥させる必要はない。少し湿っている位でも良い。)

     
  9. 乾燥が終わったら、100μlの1/5 TE(1/10 TEでもよい)を加えてボルッテックスで良く溶かす。
    (ボルテックスした後、チューブのふたを開けそれぞれのチューブにチップを差し込んでおくとよい。)

  10. パラフィルムの上にサンプルの数だけ 1μlの色素バッファーを並べ、サンプルから3〜5μlを取って色素バッファーに加えてゲル電気泳動をする。
    (必ず、ゲルが作ってあるかどうか確認しておく。)


2002.2.27: 喜多.作成