■研究法

│組織ーマーカー/トレーサー│

■物質

→マーカー　→レクチン　→ターゲットトキシン　→逆行性トレーサー

マーカー

ATF3	転写促進因子3 activating transcription factor 3 神経損傷特異的転写因子 末梢神経再生マーカー
BrdU	bromodeoxyuridine：BrdU 新生細胞のマーカー
→CRP	C反応性タンパク（C‐reactive protein） 代表的な炎症マーカー
GAP43	軸索成長のマーカー
GFAP	グリア線維性酸性タンパク質 glial fibrillary acidic protein アストロサイトのマーカー
→Iba1	ionized calcium-binding adapter molecule 1 macrophage/microglia-specific protein Iba1 マクロファージ／ミクログリアに特異的に発現している分子量17,000のカルシウム結合タンパク質
IB4	←→イソレクチンB4
MAP1b	microtubule associated protein 1b 発生期のニューロンマーカー
→MMP-3	マトリックスメタプロテアーゼ-3（matrix metalloproteinase-3 ）：MMP-3 関節リウマチで早期から上昇する血中の関節破壊マーカー
NeuN	NeuN 神経細胞のマーカー
NF200	neurofilament200 有髄神経（A線維）のニューロンマーカー TRPV2陽性細胞の大部分はNF200陽性 ラットDRGの抗TRPA1陽性細胞は小径細胞であり、NF200陰性
Peripherin	Peripherin C線維のニューロンマーカー
OX42	OX42 補体受容体iC3bを認識する。(CR3 complement receptors). 古典的なミクログリアのマーカー
PGP 9.5	protein gene product 9.5 神経線維のマーカー 脳の神経組織から発見された可溶性タンパク質 1987年にこの遺伝子の塩基配列およびアミノ酸構造が明らかにされ、その電気泳動度からPGP9.5と呼ばれている。 1990年になって、このPGP9.5はヒトの神経細胞由来のユビキチンC末端加水分解酵素１型（UCH-L1）とヒトB細胞由来の精製される３型（UCH-L3）と同じ機能をもつことが明らかになっている。
→RF	リウマトイド因子 rheumatoid factor：RF 関節リウマチのマーカー

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レクチン　→参考1/2
　レクチンとは、「糖鎖を特異的に認識して結合、架橋形成 (糖鎖と糖鎖の橋渡し) するタンパク質」、手短には、「糖鎖の解読者」。

糖鎖 glycochain 複数の糖分子が複雑に鎖状に繋がって、タンパク質や脂質と複合体を形成し、様々な細胞間情報を伝える主要な役割をしている。 各種の糖がグリコシド結合によってつながりあった一群の化合物 糖鎖は糖同士だけでなく、タンパク質や脂質その他の低分子とも結合して多様な分子を作り出す。 糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。

イソレクチンisolectin

• 同一個体内にある、同等の分子構造を持つが、特異性や等電点などに違いのあるレクチンを相互にイソレクチンと言う。

  イソレクチンB4 isolectin B4：IB4 アフリカのマメ科植物 Griffonia（Bandeeira） simplicifolia由来のレクチン 小型DRGニューロンの約半数は、植物由来のIB4で認識される糖鎖を持ち、残りの半数は持たない。 バーシカン 一般に、直鎖状B型(Galiliエピトープ)構造を検出するために使用されている(Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83:674-86)。

ガレクチン galectin　←→サイトカイン　参考1/2

• βガラクトシドに特異的に結合するレクチン
• 1975年にVivian I. Teichbergらが電気ウナギの発電器官をはじめとする様々な動物組織の抽出物中に、βガラクトシドで阻害のかかる低分子量（14-16 kDa）の赤血球凝集素を発見した。
• β-ガラクトシドに親和性を持ち、一次配列上に保存された領域をもつレクチンファミリーとして定義されている。
• 糖鎖の中でもガラクトース galctoseを含む糖鎖構造（β-ガラクトシド）によく結合することから名付けられた（galactose + lectin → galectin）。
• 脊椎動物をはじめ、線虫、昆虫、海綿動物などの無脊椎動物にも広く分布する。
• 発現場所は細胞質内にとどまらず、核、細胞表面、細胞外マトリックスと多彩で、ガレクチン分子の種類、組織、時期によって異なることが多い。
• 一般に、可溶性で、金属要求性はない。細胞質タンパク質としての属性を示し、ジスルフィド結合、付加糖鎖、シグナル配列をもたず、一般にN-末端アミノ酸はアセチル化されている。
• ガレクチンの関与する生命現象としては、発生、分化、形態形成、腫瘍転移、細胞死、RNAスプライシング等、多岐に及ぶが、機能発現の機構、特に糖鎖認識との関連については未解決部分が多い。

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• 様々な免疫調節活性が確立されていることから、ガレクチンは炎症性サイトカインとして働いている可能性も示唆されている。
• 細胞内では、ガレクチンは通常の分泌たんぱく質のように、生合成後分泌経路に入らないにもかかわらず、免疫反応が始動される時に、細胞外に能動的又は受動的に放出されることが知られている。
• 細胞外に分泌されたガレクチンは、オートクラインに分泌した細胞に結合するか、パラクラインに近傍の細胞に結合し、免疫系細胞上のガレクチンのリガンドを架橋することで、種々の免疫反応を誘起する。
• 多くのサイトカインと同様に、ガレクチンの免疫調節活性も作用が多様性で、また、重複を示す。
• 多様性・重複性は、ガレクチンが多価にリガンドに結合することにも由来するとも考えられる。可溶性のガレクチンは細胞表面上にあるリガンドを少なくとも３通りの様式で架橋することができる。すなわち、細胞接着、アゴニスト的な情報伝達、そして、ガレクチン格子の形成の3通りである。
• 注目すべきは、他のサイトカインと異なり、ガレクチンは白血球の接着分子として機能すること、そして、ガレクチン−複合糖鎖（糖タンパク質または糖脂質）格子を形成することである。細胞表面のガレクチン格子は、格子内に存在する受容体の側方拡散を拘束することにより、リガンド依存的な受容体の凝集や情報伝達を起こす閾値を高めると示唆されているので、ガレクチン格子の免疫学的な重要性が近年注目されている。

[酸化型ガレクチン-１]　参考1/2

• 堀江秀典氏らとキリンビールは、動物レクチンの一種であるガレクチン-１が、酸化型の状態で神経線維の再生を促進することを明らかにした。
• 腎由来のCos1細胞の培養上清中に、末梢神経再生促進因子が存在し、それが動物性レクチンの１種であるガレクチン-１であることが確認された。
• ガレクチン-１は運動神経や感覚神経の細胞体およびその軸索、シュワン細胞に２量体の還元型ガレクチン-１として局在している。
• In vivoの研究から、坐骨神経損傷後酸化型ガレクチン-１を投与すると、神経再生が促進され、その抗体により強く抑制されることが証明された。
• 損傷後運動神経や感覚神経細胞内でのガレクチン-１の発現は上昇し、損傷部では成長円錐や活性化されたシュワン細胞からガレクチン-１が分泌され酸化型ガレクチン-１となることが明らかにされた。
• 更に酸化型ガレクチン-１の標的細胞がマクロファージであり、刺激されたマクロファージから軸索再生並びにシュワン細胞の遊走を促進する因子が分泌されていることが判明し、末梢神経損傷後の初期過程の全貌が明らかにされた。

ターゲットトキシン／セカンドイムノトキシン　Target Toxin / Second Immunotoxin　→参考1

• 抗体またはリガンドとサポリンが結合したターゲットトキシン（イムノトキシン）
• 標的細胞膜上の抗原またはレセプターを介して細胞内に取り込まれ、サポリンの作用によってリボソームを不活性化し、標的細胞のみに特異的な細胞死を誘導することによって、細胞の機能解析を行う。
  

  サポリン　←→サポニン サポリンはナデシコ科サボンソウ属サポナリア（Saponaria officinalis）の種子に含まれるタンパク質性毒素：30 kDa リボソームを不活性化するタンパクribosome-inactivating protein (RIP)で、RNA N-glycosidaseの活性をプロセッシングする。 直接リボソームを不活性化し、極めて低濃度で細胞死を引き起こす。 抗体またはリガンドとサポリンが結合させて、ターゲットトキシンとして研究に使われる。 Substance P-Saporin：SP-SAP　→ 参考 NK 1受容体のインターナリゼーションを利用して、ニューロンのリボソームを選択的に不活性化する。

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□順行性トレーサー Neuronal anterograde tracer tracer　←→逆行性トレーサー

• 樹状突起と細胞体から標識を始め、色素は軸索とその末端へと輸送されるトレーサー
  
  →PHA-L/biocytin
  
  

  インゲンマメレクチン　Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin ：Pha-L インゲンマメ Phaseolus vulgaris (kidney bean) から単離された分子量126000の糖タンパク質 白血球を凝集させるものをPHA-L、赤血球を凝集させるものをPHA-E という。 インゲンマメ凝集素で、神経突起特異的な順行性輸送型トレーサー 軸索およびその終末を単一レベルで解析できる。 PHA-Lの注入は電気泳動的 iontophoretic でなければいけないので簡単な通電装置を必要とする。

  バイオサイチ　biocytin は感度の高い順行性トレーサー 通電装置を必要としな 注入後の生存期間（通常12ー48 時間）が短くて良いので急性実験や軸索の成長の研究ができる。

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□逆行性トレーサー Neuronal Retrograde Tracer　←→順行性トレーサー/色素

• 軸索末端から標識を始め、色素は軸索から細胞体へと逆に輸送されるトレーサー
  
  →HRP/Fluoro-Gold/Fast Blue
  
  

  西洋ワサビ過酸化酵素　Horseradish Peroxidase：HRP 最も一般的な逆行性トレーサー 反応産物は通常の光学顕微鏡で明視野観察できる。 蛍光色素と異なり観察中に目立って退色しない。

  フルオロ・ゴールド Fluoro-Gold→ 1/2 2-hydroxy-4,4'-diamidinostilbene (hydroxystilbamidine) 水溶性の神経毒。Absorption/emission: 361/536 nm. 逆行性神経トレーサーとして用いられている。 末梢神経損傷部からも取り込まれる。 1-10％濃度になるように溶媒（蒸留水、生理的食塩水など）を用いて希釈する。（2 %、1 μl） 生存期間は普通は3-5日間であるが、さらに長い生存期間をおいても蛍光は減衰しない。4% パラフォルムアルデヒドで潅流固定して、凍結切片を作成して蛍光観察する（UV 励起）。 軸索側枝の証明を目的としてFluoro-GoldとDiamidino Yellow を組み合わせた蛍光二重標識が好んで用いられる。 長所 多くの蛍光色素が有機溶媒中に溶出するのに対し、アルコール脱水やキシロール透徹に耐える。 蛍光標識はさまざまな激しい操作に耐えるので免疫組織化学やin situ hybridization 法との多重標識や、酵素抗体法やトレーサーとしてのHRPとの二重標識も可能である) 。 蛍光標識は強く、蛍光観察中に褪色しにくい。 長期間の生存期間をおいても標識ニューロンからラベルが失われない。 抗Fluoro-Gold抗体を用いて免疫組織化学的に証明することもできる。 短所 細胞毒性が指摘されているが、細胞毒性は無いとする報告もある。

  ファースト・ブルー Fast Blue → 1 鋭敏な逆行性蛍光色素である。 細胞毒性がない。 通常、3-5日間の生存期間をおく。ただし1-2日でも小動物の短い神経回路であるならば十分である。 Fast Blue が細胞質を青く、Diamidino Yellowが細胞核を黄色に標識することより、Fast Blue とDiaminido Yellowの二重標識法により軸索側枝を証明することができる。 Fast Blue のかわりにTrue Blue も同じ研究目的として用いられる。 Fast Blue は蛍光免疫組織化学やin situ hybridization による二重標が可能である。 長所 細胞毒性が低い。 高感度の逆行性トレーサー 分解されにくい（Long survival experimentに適している）。 二重標識を施しやすい。 短所 注入部位が拡散しやすい。 UV 励起 なので観察中に退色しやすいことなどである。

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